Prinsip Kerja dan Tahapan Proses PCR
Prinsip kerja PCR didasarkan pada kemampuan enzim DNA polimerase untuk mensintesis untai DNA baru yang merupakan komplementer dari DNA cetakan. Komponen utama reaksi PCR terdiri dari: template DNA atau DNA cetakan; primer yang didesain; enzim DNA polimerase; dan nukleotida (dNTP atau deoxynucleoside triphosphate). Kunci dalam pelaksanaan reaksi PCR membutuhkan Taq Polymerase, Primer, DNA templat, dan nukleotida (blok pembangun DNA). Keseluruhan bahan digabung dalam sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan dan pendinginan berulang yang memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA. Proses PCR melewati 3 tahap berikut: 1. Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded). 2. Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA. 3. Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru. Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan waktu sekitar 2-4 jam bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi. Jika reaksinya efisien, wilayah target dapat berubah dari hanya satu atau beberapa salinan menjadi milyaran. Karena ada banyak salinan atau untai ganda primer dan banyak molekul Taq polymerase yang mengambang di sekitar reaksi, sehingga jumlah molekul DNA kira-kira bisa berlipat ganda dalam setiap putaran siklus.